所属单位：扬州大学兽医学院;中国农业科学院上海兽医研究所;山东农业大学动物科技学院;
发表刊物：微生物学通报
关键字：滑液支原体;;醛缩酶;;原核表达;;亚细胞定位;;免疫原性
摘要：【背景】滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)感染能够引起鸡和火鸡的气囊炎、关节渗出性的滑液囊膜及腱鞘滑膜炎等。有研究表明,许多支原体中与代谢相关的酶类不仅分布在细胞质,也分布于细胞膜表面,通过结合宿主细胞的胞外基质蛋白,协助病原菌黏附入侵宿主细胞。已有报道牛支原体(Mycoplasma bovis)和鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum)的醛缩酶(Fructose-bisphosphate aldolase,FBA)分布在膜蛋白和胞浆蛋白中,而MS的FBA蛋白还未见相关研究。【目的】对MSFBA蛋白进行生物信息学分析、原核表达、免疫原性分析及亚细胞定位检测,为进一步探索MS代谢相关酶类的生物学功能奠定基础。【方法】通过分析软件PSORTb、SignalP 4.1 Server和TMHMM Server在线预测MSFBA的亚细胞定位、信号肽及跨膜区,并用BLASTn和MEGA 5.0进行同源比对及进化树分析;通过Overlap PCR点突变扩增MS的fba全基因序列,连接表达载体pET-28a(+)并进行原核表达及纯化,获得纯化后的重组MSFBA(rMSFBA)蛋白;用MS阳性血清进行Westernblot鉴定rMSFBA的免疫原性;用纯化的rMSFBA蛋白制备兔多克隆抗体,与MS全菌蛋白、膜蛋白及胞浆蛋白进行Western blot分析,同时对MS全菌进行悬浮免疫荧光分析,检测MSFBA的膜定位情况。【结果】生物信息分析预测MSFBA分布在细胞质中,无信号肽,无跨膜区,在MS种内相似性高达99%,与其他种属FBA相似性在61%-78%之间,进化树显示其与牛鼻支原体(Mycoplasma bovirhinis)、仓鼠支原体(Mycoplasm acricetuli)等的FBA蛋白进化关系较近,与精氨酸支原体(Mycoplasma arginini)、人型支原体(Mycoplasma hominis)等的FBA蛋白进化关系较远;表达rMSFBA蛋白并纯化,经测定其相对分子质量大小约为33kD;rMSFBA能与MS阳性鸡血清特异性结合,证实其具有较好的免疫原性;Western blot显示抗rMSFBA的兔血清能与MS全菌蛋白和胞浆蛋白反应,而与膜蛋白不反应,说明MSFBA蛋白分布于胞浆中;悬浮免疫荧光实验证实MS的细胞膜上未见FBA蛋白分布。【结论】首次报道了滑液支原体的FBA蛋白是一个高度保守的免疫原性蛋白,主要分布在细胞质中,该结果为进一步研究MSFBA蛋白的生物学功能提供了分子基础。
第一作者：王宇
论文编号：20210428014
卷号：46
期号：04
页面范围：780-789
是否译文：否
发表时间：2019-01-01